Структурная модификация белков сои как перспективная био- и нанотехнология

Автор: Ю. А. Шушкевич,  
ООО «Кубанский соевый концентрат»  
Соавторы: М. Л. Доморощенкова (ГНУ ВНИИЖ Россельхозакадемии)
и Д. Хайес (Hayes General Technologies, Израиль)

Самый эффективный метод

1. Введение в проблематику

Решение проблемы дефицита белка — одной из глобальных проблем, стоящих перед человечеством, — невозможно без использования сырьевых ресурсов растительного происхождения, прежде всего получаемых при переработке семян масличных и зернобобовых культур. В этом контексте белкам сои традиционно отводилась ведущая роль. Высокое содержание ипищевая ценность соевого белка при развитых технологиях высокобелковых продуктов — соевой муки, концентратов и изолятов — обеспечили их широкое использование в пищевой промышленности и в питании населения. В 2005 году мировое потребление соевого изолята составляло 350 тыс. тонн, соевого концентрата 500 тыс. тонн^[1]. По прогнозу LMC International Ltd., одной из ведущих британо-американских консалтинговых компаний в области пищевой промышленности и сельскохозяйственных рынков, к 2020 году мировой рынок соевых изолятов вырастет до 1,6 млн. тонн, соевых концентратов — до 5,6 млн. тонн. Прогнозируется, что до половины рынка казеина и казеинатов и часть рынка сывороточных белков молока может быть замещена соевыми белковыми продуктами^[2].

Соевые белки пищевого качества имеют различное назначение. Так, для восполнения дефицита белков животного происхождения, проблема которого особенно остро стоит в развивающихся странах, достаточно использование соевой муки, концентрата и изолята, производимых по классическим технологиям, известным с середины XX века. В то же время для удовлетворения спроса на белковые ингредиенты с развитыми функционально-технологическими свойствами и улучшенными медико-биологическими характеристиками, необходимы новые технологические решения. В последние 10-15 лет были исследованы и подтверждены профилактические и лечебные свойства соевых пептидов, флавоноидов, олигосахаридов и других фитохимических соединений, содержащихся в семенах сои и продуктах их переработки. В связис этимна повестку дня встал вопрос об активизации соответствующих биологически активных факторов в массово выпускаемых белковых продуктах, о повышении их специфичности и о создании промышленных технологий их извлечения, очистки и концентрирования.

2. Структурная модификация белков

Одним из перспективных и экономически эффективных направлений развития и улучшения характеристик пищевых белков является их структурная модификация.

Первые упоминания о структурной модификации соевых белков относятся к 1940-м годам, когда в США велись исследования по получению устойчивых к нагреванию пенообразователей для военно-морского флота. Для этого использовался ферментативный гидролиз соевой муки при низких значениях pH (2.0-3.5), в результате которого образовывались полипептиды с молекулярной массой не менее 14000 Да. До появления синтетических поверхностно-активных веществ «бобовый суп» считался лучшим пенообразователем по показателям силы вспенивания и устойчивостью против оседанияв условиях высокой температуры^[3].

На сегодняшний день под структурной модификацией белковых соединений сои можно понимать получение в процессе управляемой деструкции и/или направленной химической, ферментативной или физической модификации исходных биополимеров соевого белка или продуктов их гидролиза новых белковых производных, в том числе более низкомолекулярных белков и полипептидов с улучшенными или принципиально новыми функциональными и медико-биологическими свойствами и с измененными физико-химическими характеристиками.

Термин «структурная модификация белковых соединений» в отечественных научных публикациях по состоянию на сегодняшний день встречается пока что достаточно редко,обычно используются более общее определение «модификация белков» или, как частный случай, «гидролиз белков», в то время как в зарубежной научной литературе термин «structural modification ofprotein» широко распространен^[4].

Структурные характеристики соевых белков довольно хорошо изучены^[5]. Соевые белки можно разделить на группы полипептидов, различающихся по молекулярной массе. В зависимости от скорости седиментации они условно подразделяются на 2S, 7S, 11S и 15S фракции. В свою очередь, каждая фракция является сложной смесью белков, различающихся по своим характеристикам.

Основными фракциями, определяющими функциональность соевого белка, являются 7S в- и г-конглицинины (М.м. 150-175 кД) и 11S-гицинин (М.м. 320-350 кД), на долю которых приходится более 80% суммарных белков.

При электрофорезе по Лаемли глицинин и конглицинины распадаются на отдельные полипептиды:

• в-конглицинин: б’ — 80 кД, б — 76 кД, в — 50 кД;
• г-конглицинин: 66-65 кД;
• глицинин: кислые субъединицы — 45-37 кД, основные субъединицы — 22-19 кД.

В качестве основного инструмента управляемой деструкции глобулинов сои используется ферментативный гидролиз, который может быть дополнен мембранной фильтрацией^[6], гомогенизацией,эмульсионной экстракцией^[7], изоэлектрическим фокусированием и промышленной жидкостной хроматографией^[8]. В ряде случаев структурная модификация может осуществляться посредством реакций пластеинового синтеза, позволяющими изменить функциональные свойства или улучшить аминокислотный состав продукта (например, повысить содержание одной или нескольких аминокислот, удалить «горькие» аминокислоты)^[9]. Завершающей стадией технологического процесса (если продукт не реализуется в жидком виде) является распылительная сушка продукта при специальныхтемпературных режимах.

Структурная модификация предполагает существенное изменение физических и химических характеристик белка, раскрытие или формирование новых свойств. Ниже приводится краткая характеристика того, как и каким образом применяемые при структурной модификации методы влияют на свойства конечных продуктов.

При гидролизе как таковом происходит укорачивание молекул отдельных полипептидов, высвобождение и активация новых химических связей, в частности, SH-связей и т.д., «высвобождение» или экспонирование на поверхность отдельных гидрофильных или гидрофобных групп, в результате чего получаемые соединения обладают новыми, отличными от исходного субстрата, свойствами растворимости, жироэмульгируемости,влаго- и жироудержания, антиоксидантными свойствами, реологическими характеристиками.

Получаемые в процессе структурной модификации пептиды и полипептиды классифицируются в нанодиапазоне от 5 до 100 нм.

Высокая субстратная специфичность применяемых при гидролизе энзимов позволяет направленно вести реакции по строго определенным связям, добиваясь получения определенных групп пептидов и полипептидов, которые в последующем могут быть отсепарированы с необходимой степенью чистоты.

Кроме того, наряду с реакциями гидролиза при использовании некоторых ферментов могут катализироватьсяи реакции сшивания белков поперечными связями — так, в процессе гидролиза, катализируемого трансглутаминазой,образующиеся «сшивки» между остатками лизина и глутамина в полипептидной цепи усиливают желирующие свойства и могут быть использованы для изготовления микрокапсул для иммобилизованных ферментов^[10].

Использование при гидролизе щелочных реагентов позволяет получать протеинаты, наиболее распространенными среди которых являются протеинаты натрия, кальция и калия; которые обладаютразными функциональными свойствами. В работе Л. В. Гапоновой было показано, что жироудерживающая и водоудерживающая способности максимальны у соевых протеинатов калия, пенообразующая способность — у протеината натрия, жироэмульгирующая способность — у соевых протеинатов кальция.^[11] То есть имеет место выраженное влияние катионов щелочных и щелочноземельных металлов на функциональные свойства протеинатов соевого белка.

Известно,что конформация белка влияет на его физико-химические свойства. Конформация белка чувствительнак особенностям аминокислотной последовательности и характеристикам растворителя. Сворачивание полипептида при формировании пространственной структуры определяется термодинамическими факторами.Для водорастворимых белков большинство неполярных остатков находится внутри, а большинство полярных остатков на поверхности глобулы, находящейся в контакте с растворителем. Этим достигается минимизация свободной энергии белковой структурыпри данных условиях и свойствах раствора. В общем случае, в глобулярных белках гидрофобные остатки находятся внутри, а гидрофильные большей частью на поверхности. Поэтому нативные глобулярные белки обычно обладают высокой растворимостью. В процессе промышленного получения очищенных фракций белков в результате денатурации в белке происходят структурные изменения, приводящие к снижению егорастворимости и изменению функциональности. Так, нагревание белковых растворов приводит к увеличению доли гидрофобных участков на поверхности^[12].В процессе гидролиза и физических воздействий — сдвиговых деформаций при гомогенизации — происходит изменение пространственной структуры с увеличением удельной конформационной энергии белковых частиц. В результате этих процессов неполярныегидрофильные остатки (R-группы серина, треонина, тирозина, цистеина, глицина и др.) оказываются в большей степени экспонированными на поверхность, что повышает растворимость^[13] этих частиц. Образование белковых частиц с преобладанием гидрофобных R-групп (аланина, лейцина, изолейцина, валина и пролина), позволяет получать фракции с повышенными жироэмульгирующими характеристиками. Отметим также, что по данным тайванских ученых даже без дорогостоящего разделения по преобладающим аминокислотным остаткам концентрат соевых пептидов является превосходным эмульгатором и может быть эмульгирован с водой и жиром в соотношении 1:7:1 с сохранением стабильной эмульсии, тем самым полностью заменяя лецитин в качестве эмульгатора^[14]. Иными словами, получаемый продукт с наночастицами белка обоих типов может сбалансировано обладать как свойством растворимости, так и являться эмульгатором.

Уже упоминавшиеся сдвиговые деформации в процессе гомогенизации при высоком давлении не только физически обеспечивают деструкцию белковых глобул наполипептидные фрагменты, но и способствуют их стабилизации и снижению агрегирования.Имеются сведения, что в результате физического воздействия сдвиговых деформаций при гомогенизации на поверхности белковых частиц экспонируются SH-группы цистеина, обеспечивающие выраженный антиоксидантный эффект продукта (SH-группы выступают как конкурирующие с другими субстратами объекты окисления, которые не дают свободных радикалов и фактически гасят цепную реакцию свободнорадикального окисления^[15]).

Благодаряуменьшению молекулярной массы получаемых белковых частиц значительно возрастает их термостабильность, повышается устойчивость к ионной силе раствора (концентрации соли).

Таким образом, при проведении структурной модификации белков возможно применение широкого набора биотехнологических, химических и физических методов воздействия,а также методов выделения, очистки и концентрирования, позволяющих получать вещества с заданными характеристиками как в смесевых системах, так в виде субстанций с необходимым уровнем чистоты.

Необходимо отметить, что в литературе также упоминается об эксперименте, проведенном тайваньскими учеными по получению наночастиц соевого белка с размерами менее 100 нм путем сверхскоростного механического размола непосредственно соевых бобов. При этом полученные наночастицы соевого белка, свободные от полисахаридов и фосфолипидов, обладали повышенной биологической активностью, в частности, способствовали повышению иммунного статуса у лабораторных мышей^[16]. По-видимому, всякий способ«высвобождения» пептидов сои вне зависимости от применяемой для этого технологии обеспечивает получение продуктов с выраженным проявлением новых химических и биологических свойств. Тайваньские исследователи ничего не сообщают о стоимости наночастиц соевого белка, полученных при механическом размоле, но, судя по всему, стоимость такой технологии на порядок превосходит стоимость гидролизного процесса. Учитывая стремительное развитие биотехнологии и появление на рынке все большего количества ферментных препаратов с высокой субстратной специфичностью и активностью, процесс структурной модификации на основе гидролиза является на сегодняшний день наиболее экономически перспективным.

3. Возможности структурной модификации в формировании новых функциональных свойств продуктов

Выше был дан анализ системы воздействий, которые могут применяться в процессе структурной модификации белков сои. Эти воздействия позволяют управлять функционально-технологическими и медико-биологическими свойствами конечных продуктов.

Ниже в таблице приводится перечень технологических воздействий, необходимых для достижения заданных свойств продуктов в процессе структурной модификации белков сои

Таблица 1: Перечень технологических воздействий

Свойства	Технологические воздействия, применяемые для достижения свойства
Структурная модификация белков осуществляется на уровне изменений свойств частиц...
Растворимость в воде	Гидролиз, катализируемый ферментамиСдвиговые деформации в процессе гомогенизации при высоком давлении
Удержание жира и воды в эмульсии	Гидролиз + гомогенизация + сепарирование частиц с гидрофобными R-группамиили –гидролиз в щелочной среде с образованием протеината калия
Эмульгирующая способность	Гидролиз + гомогенизация + сепарирование частиц с гидрофобными R-группамии/или –гидролиз в щелочной среде
Повышенная антиоксидантная активность	Гидролиз с использованием ферментов с субстратной специфичностьюпо SH-связям + гомогенизация (высвобождение SH-связей)
Повышенная термическая стабильность	Продолжительный гидролиз с высокой степенью гидролиза (DH)
Устойчивость к соли (NaCl) в пищевых приложениях	Гидролиз с образованием протеината натрия
Устойчивость против агломерации	Гомогенизация при высоком давлении
Максимизация содержания специфическихпептидов	Гидролиз с использованием ферментов с заданной субстатратной специфичностью, ультрафильтрация
Максимизация содержания свободных аминокислот	Максимально глубокий гидролиз с DH?100%, ультрафильтрация
Микрокапсулирование белковых наночастиц	Использование «сшивающих» реакций, катализируемых трансглутаминазой
Создание белковых наночастиц заданного состава	Пластеиновый синтез

Обсуждаемая структурная модификация белков осуществляется на уровне изменений свойств частиц нанометрового масштаба с использованием разнообразных химических, биохимических и физических методов.

Получаемые фрагменты белковых частиц наноразмерного масштаба обладают свойствами, которые напрямую зависят от их размера и атомарной структуры поверхности. То есть данный процесс относится к области нанотехнологий. При этом, хотя основная часть преобразований осуществляется по схеме top-bottom, часть из них предполагает обратный процесс bottom-top (микрокапсулирование, пластеиновый синтез).

Таким образом, структурная модификация белков на основе биокатализа открывает широкие возможности для получения веществ с заранее заданными управляемыми характеристиками.

4. НИР по структурной модификации, основные авторы и публикации, внедрение

Активная научно-исследовательская работа по тематике структурной модификации белков началась в 1970-х годах, одновременно с исследованиями по пластеиновому синтезу, однако значительная часть работ по данной тематике в СССР была засекречена. Наиболее крупным зарубежным результатом, получившим широкое коммерческое применение с 1980 года, стала технология рефолдинга соевого концентрата с целью восстановления его растворимости в водных растворах (в процессе спиртовой обработки, являющейся неотъемлемой частью технологии получения соевого концентрата, белок денатурирует и утрачивает свойство растворимости). В процессе рефолдинга структурнаямодификация осуществляется в условиях центробежной гомогенизации при повышенной температуре в щелочных условиях^[17].Действующими факторами при рефолдинге выступают химический гидролиз соевого глобулина в присутствии щелочи и сдвиговые деформации, достигаемые при гомогенизации, обеспечивающие интенсификацию реакции гидролиза, обеспечивающее высвобождение гидрофильных групп и снижающие агломерационную способность частиц готового белка.

В СССР исследования по структурной модификации белковых соединений растительного сырья осуществлялись в рамках закрытой тематики НИР НПО «Масложирпром».Одной из наиболее полных научных публикаций по данной тематике стала диссертационная работа М.Л.Доморощенковой «Разработка технологии получения модифицированных белков из соевого шрота с использованием биотехнологических методов» (1991 г.)^[18]. В указанной работе было изучено влияние природы протеаз и степени гидролиза на физико-химические и функциональные свойства соевых белков, исследованы технологические режимы процесса ферментативной модификации, исследованы химические, функциональные и медико-биологические свойства модифицированных соевых белков.

Была прослежена избирательность гидролиза отдельных субъединиц соевых глобулинов при действии разных протеаз.

При действии щелочных и слабощелочных протеаз гидролизу подвергались следующие полипептиды:

• б-, б’-полипептиды в-конглицинина и г-конглицинин > в-полипептиды в-конглицинина > кислые пептиды глицинина > основные полипептиды глицинина
• / КГ (7S) > кислые ГЛ (11S) > основные ГЛ (11S) /.

При действии нейтральной протеазы Bac. Subtilis, обладающей субстратной специфичностью к гидрофобным аминокислотам с N-конца расщепляемой связи, частичному расщеплению подверглись все полипептиды.

При действии кислых протеаз:

• кислые полипептиды глицинина > б-, б’-полипептиды в-конглицинина и г-конглицинин > в-полипептиды в-конглицинина > основные пептиды глицинина
• / кислые ГЛ (11S) > КГ (7S) > основные ГЛ (11S) /.

Различия в динамике гидролиза и в полипептидных спектрах ферментативно модифицированных белков были обусловлены разной субстратной специфичностью использованных ферментов и особенностями биохимического строения отдельных субъединиц соевых глобулинов. Таким образом, уже в 90-е годы была показана возможность направленной деструкции белковых биополимеров.

К большому сожалению, в более поздние годы фундаментальные и прикладные научно-исследовательские работы по тематике структурной модификации белковых соединений в нашей стране проводились очень ограниченно. Из опубликованных работ отечественных ученых по локальным аспектам соответствующей тематики можно, не претендуя на полноту, упомянуть выполненные в ГУ НИИ Питания РАМН и Московском государственном университете прикладной биотехнологии работу по получению и исследованию ферментативного гидролизата изолята соевых белков^[19], выполненное в Санкт-Петербургском государственном университете низкотемпературных и пищевых технологий исследование по типам химических реакций, катализируемых микробным ферментном трансглутаминазой на субстратах, представленных глобулинами сои^[20],исследование протеолиза сывороточных белков молока с применением электроактивации, выполненные в Северокавказском государственном техническом университете^[21] и некоторые другие. Проведение более масштабных НИР в России сдерживается отсутствием целевого государственного финансирования и потенциально заинтересованных в их результатах предприятий по глубокой переработке сои и получению сывороточных белков молока.

Таким образом, технологии структурной модификации белковых соединений в нашей стране до сих пор не вышли за пределы лабораторий.

В то же время в зарубежных странах данное направление активно развивалось. В 2002-2004 гг началось промышленное производство гидролизатов соевых белков на заводах по глубокой переработке сои компаний ADM (США), Solae (США) и Solbar (Израиль). Большую роль в научно-технологическом обеспечении соответствующих производств сыграл израильский биотехнолог Д.Хайес (D.Chajuss). В течение 2005-2008 гг. аналогичные производства появились в Китае и Малайзии. Производство гидролизатов соевого белка осуществляет компания Fuji Oil (Япония). По мнению специалистов, работающих в данной области, в настоящее время мировой центр научных исследований по тематике ферментативного гидролиза белков находятся в Японии, на Тайване, а такженаращивается интенсивность исследовательских работ в Китае и в Южной Корее^[22].

В начале 2000-х годов в научной литературе появились публикации об уникальных биологически активных свойствах низкомолекулярного пептида луназина, выделенного из семян сои или из соевых белков. Луназин состоит из 43 аминокислотных остатков, имеет молекулярную массу 5.45 ± 0.25 кД и является отдельной субъединицей 2S альбумина. Cодержание природного луназина в семенах сои очень незначительно, но его концентрация резко возрастает в результате гидролиза белков^[23][24][25].

В 2009 году американская фирма Soy Labs, LLC заявила о начале коммерциализации двух видов препаратов, LunaSoy® иLunasin XP®, основанных на экстракте луназина, которые можно использовать в функциональных продуктах питания и напитках.

В этом контексте необходимо отметить, что производство биологически активных добавок на основе выделенных соевых пептидов в Китае переживает на сегодняшний день настоящий бум. Но из-за того, что практически все производство ориентировано на внутренний рынок, потребительская информация и научные публикации на английском или русском языках практически недоступны. Также отсутствуют точные сведения о применяемых технологиях (известно лишь, что в их основе лежит управляемый гидролиз), о биохимическом составе и чистоте продуктов. Известными производителями препаратовпептидов в Китае являются компании, занимающиеся производством пищевых соевых белков, такие как Harbin Ho-Tech Soybean Food Co Ltd, компания Guangzhou Hisoya Biological Science,Lynyi Shansong Bilogical Products Co.и другие.

Необходимо отметить поставленный в США интересный опыт по получению биополимеров путем образования катализируемых трансглутаминазой связей между молекулами сывороточного белка молока и глобулинами сои. Несмотря на большую молекулярную массу 200 тыс. Да (исследователи не подвергали исходные белки деструкции) полученный биополимер обладал новыми функциональными свойствами^[26]. Вполне очевидно, что применение подобного механизма полимеризации по отношению к наноразмерным структурированным белковым частицам позволит создавать вещества с новыми характеристиками.

Интерес к технологии структурной модификации белковых соединений сои связан с желанием ведущих мировых производителей как улучшить функциональные свойства выпускаемых ими пищевых белков, так и осуществить выделение и выпуск в товарных количествах определенных типов соевых полипептидов и пептидов с подтвержденными медико-биологическими свойствами. При этом последняя мотивация играет значительно более важную роль, поскольку речь идет о фактическом переходе производителей из сектора пищевых ингредиентов (food ingredients) в фармакологический сектор, характеризующийся значительно большими уровнями спроса и добавленной стоимости.

В силу этого обстоятельства количество открытых зарубежных публикаций по темам, относящимся к наноструктурной модификации соевых белков, весьма невелико. Исследования носят, в основном, корпоративный характер, их результаты обнародуются, в лучшем случае, частично и после завершения коммерциализации новых продуктов.

В минувшем 2009 году были обнародованы предварительные результаты проведенных в США исследований, показывающие «исключительную ценность использования полипептидов при создании наноструктурных объектов»^[27]. Принимая во внимание то обстоятельство, что полипептиды соевого белка в рамках имеющихся технологий могут производиться в значительных промышленных объемах, производство соответствующих наноматериалов буквально сразу же после завершения НИОКР может стать массовым и экономически эффективным.

Таким образом, структурная модификация белков сои является эффективным методом при создании веществ с новыми свойствами, широко востребованных в различных технологиях и сферах человеческой деятельности.